摘要：生物超弱發(fā)光是生物系統(tǒng)在生命活動(dòng)中的微弱發(fā)光現(xiàn)象。為了準(zhǔn)確測(cè)量生物超弱發(fā)光，設(shè)計(jì)了一種用于生物超微弱發(fā)光的專(zhuān)用采集系統(tǒng)。系統(tǒng)的激發(fā)光源由單只大功率LED及光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)成，用壓控恒流源調(diào)整LED光照強(qiáng)度，通過(guò)電子快門(mén)精確控制光探測(cè)器的采集時(shí)間。測(cè)量金心吊蘭葉片的延遲發(fā)光結(jié)果表明，該系統(tǒng)測(cè)量精度高、重復(fù)性好。
關(guān)鍵詞：生物超弱發(fā)光；檢測(cè)；電子快門(mén)；壓控恒流源

O 引言
    生物超弱發(fā)光是生物在生命活動(dòng)過(guò)程中，輻射出的一種極其微弱的光子流，分為自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，它與生理代謝、光合作用和細(xì)胞分裂等等許多生命過(guò)程有關(guān)，并且對(duì)環(huán)境極為敏感。由于生物超弱發(fā)光蘊(yùn)涵著豐富的生命信息，對(duì)其探測(cè)、分析與解讀是近十幾年來(lái)許多領(lǐng)域共同關(guān)心的課題。目前，已有不少研究，展示出其在揭示生命運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)理以及農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療、食品衛(wèi)生等許多領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。由于生物超弱發(fā)光的強(qiáng)度較弱，且延遲發(fā)光衰減很快，其采集涉及到外來(lái)激發(fā)光的精確控制和微弱自體發(fā)光的實(shí)時(shí)測(cè)量，至今未見(jiàn)成熟的專(zhuān)用儀器，給研究帶來(lái)困難。鑒于此，本文開(kāi)發(fā)了一類(lèi)利用LED激發(fā)的生物超弱發(fā)光采集系統(tǒng)，將LED激發(fā)光源、電子快門(mén)和光探測(cè)器整合在一起，通過(guò)單片機(jī)精確控制激發(fā)光源的光照時(shí)間與電子快門(mén)的開(kāi)啟時(shí)間，使超弱發(fā)光尤其是延遲發(fā)光重復(fù)性測(cè)量的精度大大提高。

1 系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)
    該系統(tǒng)測(cè)量生物超弱發(fā)光的時(shí)域信息，采用單光子計(jì)數(shù)探測(cè)系統(tǒng)。主要包括激發(fā)光源、光源驅(qū)動(dòng)電路、快門(mén)控制模塊、光探測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與處理模塊、溫度控制模塊、暗室和計(jì)算機(jī)。系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

    樣品放在暗室中測(cè)量，隔絕外界光線影響。單只大功率超高亮度LED發(fā)出的光經(jīng)過(guò)透鏡變換為平行光后，均勻照射到樣品上，中控模塊的單片機(jī)精確控制光強(qiáng)和輻照時(shí)間，溫度控制器保持樣品處于恒溫狀態(tài)，快門(mén)驅(qū)動(dòng)模塊按照預(yù)設(shè)程序控制電子快門(mén)的開(kāi)閉，PMT進(jìn)行生物發(fā)光的采集。

2 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)
2．1 主控制電路
    主控電路負(fù)責(zé)整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行，進(jìn)行光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和快門(mén)開(kāi)閉的控制，結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。主要包括微處理器、壓控電流源、光照時(shí)間控制、快門(mén)開(kāi)關(guān)控制、LCD顯示、鍵盤(pán)接口和溫度控制模塊。

2．2 激發(fā)光源及其驅(qū)動(dòng)電路
    生物體的自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度較穩(wěn)定，而延遲發(fā)光隨時(shí)間衰減很快，若將樣品用激發(fā)光源在暗室外照射后再拿進(jìn)暗室測(cè)量，光照結(jié)束時(shí)間和測(cè)量開(kāi)始時(shí)間的間隔很難控制，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技能要求較高。如果采用光源內(nèi)置的方法，就能很好地解決這個(gè)問(wèn)題。
    系統(tǒng)采用單只大功率發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源，通過(guò)透鏡變換為平行光，保證樣品受光面的光強(qiáng)均勻分布。激發(fā)光源采用藍(lán)色LED，中心波長(zhǎng)為467nm，帶寬為20nm，可以滿足一般實(shí)驗(yàn)要求。也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，將藍(lán)色LED更換為紅色、綠色和紫色等顏色的LED。
    對(duì)LED光強(qiáng)的控制通過(guò)改變注入LED的電流大小來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了保證實(shí)驗(yàn)的精度，要保證LED驅(qū)動(dòng)電流的恒流性，還要使得電路的電流大小可調(diào)，實(shí)現(xiàn)光源亮度的調(diào)節(jié)。因此，系統(tǒng)選用精密數(shù)控大功率電流源電路作為L(zhǎng)ED的驅(qū)動(dòng)電路。電路的原理圖如圖3所示。

    驅(qū)動(dòng)電路主要由微處理器、液晶顯示與鍵盤(pán)輸入、數(shù)／模轉(zhuǎn)換與模／數(shù)轉(zhuǎn)換、壓控恒流源、差動(dòng)放大電路等子模塊組成。
2．2．1 壓控恒流源
    壓控恒流源是LED驅(qū)動(dòng)電路的重要組成部分，它的功能是通過(guò)調(diào)節(jié)控制電壓來(lái)達(dá)到對(duì)電流的控制，它的性能決定了LED亮度的穩(wěn)定程度。壓控恒流源的電路如圖4所示，U1B和R8，R9構(gòu)成電壓跟隨器，運(yùn)放的高輸入阻抗，近似可以認(rèn)為U1B沒(méi)有分流作用，則流經(jīng)V2的電流全部流入負(fù)載RL，并且有V3=V2。U1C和電阻R10，R11，R12構(gòu)成反相器，有V4=-V3=-V2。U1A和電阻R1，R2，R3，R13構(gòu)成反向加法器電路，輸入信號(hào)分別為Vi和V4，輸出電壓V1=-(Vi+V4)，又因?yàn)閂4=-V2，所以輸出電壓V1=-(Vi-V2)。運(yùn)放UB1并無(wú)分流作用，因此電阻Rm兩端的電壓為Vm=V1-V2=-Vi，流經(jīng)Rm和負(fù)載RL的電流相等，都為I=Vm／Rm=-Vi／Rm?？梢钥闯?，負(fù)載上的電流由輸入電壓Vi和電阻Rm共同決定，只要這兩個(gè)量不變，電流就會(huì)保持恒定。通過(guò)改變數(shù)模轉(zhuǎn)換器的輸出電壓，即可調(diào)節(jié)負(fù)載RL上的電流。

    負(fù)載RL是大功率的LED，所需要的驅(qū)動(dòng)電流一般在0～300 mA，為了保證恒流電路的功率輸出，加入了電流擴(kuò)展電路。該擴(kuò)展電路采用簡(jiǎn)單常用的圖騰柱式電流擴(kuò)展方法。功率三極管使用大功率的2N1346，同時(shí)連接散熱片并加裝散熱風(fēng)扇，以保證電路穩(wěn)定工作。
2．2．2 差動(dòng)放大電路
    輸出電流經(jīng)采樣電阻Rm采樣，接入差動(dòng)放大電路的輸入端。在電流源電路中，采樣電阻的精確程度和溫度穩(wěn)定性直接關(guān)系到電流輸出的穩(wěn)定性。因此系統(tǒng)中采樣電阻使用精密金屬膜電阻，該電阻溫漂小于5x10-5℃-1，阻值為2 Ω，額定功率為10 W。
    差動(dòng)放大電路使用較常用的儀用放大器，電路原理如圖5所示。

    儀用放大電路具有較高的輸入阻抗，能夠避免采樣電路對(duì)電流源的影響；同時(shí)又具有較大的共模抑制比，保證采樣的準(zhǔn)確性，避免干擾。由于采樣電阻Rm上流經(jīng)的電流變化范圍是0～300 mA，范圍較大，所以將差動(dòng)放大電路的放大倍數(shù)設(shè)置為1。
2．2．3 數(shù)／模和模／數(shù)轉(zhuǎn)換
    數(shù)／模轉(zhuǎn)換采用C8051F021單片機(jī)內(nèi)部集成的DAC1，DAC的輸出在每次中斷時(shí)根據(jù)A／D的采樣值計(jì)算后進(jìn)行更新。
    模／數(shù)轉(zhuǎn)換采用單片機(jī)內(nèi)部集成的12位逐次逼近寄存器型ADC。A／D和D／A的電壓基準(zhǔn)VREF由片外的LM336基準(zhǔn)穩(wěn)壓源提供。
2．3 快門(mén)控制
    為了防止LED光強(qiáng)對(duì)PMT造成損傷，在樣品室與PMT之間加裝了電子快門(mén)來(lái)保護(hù)PMT。開(kāi)啟LED時(shí)，快門(mén)關(guān)閉；激發(fā)光源照射樣品結(jié)束時(shí)，LED熄滅，快門(mén)打開(kāi)，PMT開(kāi)始采集樣品的發(fā)光。由于延遲發(fā)光快速衰減，為了保證能夠及時(shí)采集延遲發(fā)光，該系統(tǒng)采用的電子快門(mén)的響應(yīng)時(shí)間為1μs，快門(mén)驅(qū)動(dòng)電壓為(12±O．1)V，電路接通則快門(mén)開(kāi)啟，斷開(kāi)則快門(mén)自動(dòng)關(guān)閉，控制簡(jiǎn)單。但電子快門(mén)對(duì)電壓穩(wěn)定度要求較高，需要采用單獨(dú)的穩(wěn)壓電源供電，否則有可能因電壓波動(dòng)造成快門(mén)意外關(guān)閉。
    電子快門(mén)驅(qū)動(dòng)電路如圖6所示，開(kāi)關(guān)管連接單片機(jī)P2．7口，由單片機(jī)控制快門(mén)的開(kāi)啟和關(guān)閉。當(dāng)單片機(jī)P2．7口輸出為“0”時(shí)，快門(mén)關(guān)閉；當(dāng)單片機(jī)P2．7口輸出為“1”時(shí)，快門(mén)打開(kāi)。用示波器測(cè)量驅(qū)動(dòng)電路的延遲時(shí)間在1μs以內(nèi)，考慮到快門(mén)的延遲也在1μs，可以認(rèn)為快門(mén)總體的延遲對(duì)測(cè)量的影響可以忽略。

3 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)
    系統(tǒng)軟件部分采用模塊化設(shè)計(jì)方法，將整個(gè)程序劃分為若干模塊，通過(guò)主程序?qū)Ω鱾€(gè)子模塊的調(diào)用，將模塊連接成一個(gè)完整的程序。
    根據(jù)系統(tǒng)控制功能的要求，確定了系統(tǒng)軟件的主要功能有：系統(tǒng)初始化，寄存器設(shè)定，鍵盤(pán)設(shè)定初始值(光照時(shí)間，快門(mén)開(kāi)啟時(shí)間，流過(guò)LED的電流值大小)，液晶顯示控制，電子快門(mén)控制。根據(jù)軟件的功能要求，圖7給出程序總體流程結(jié)構(gòu)圖，圖8表示各模塊之間的邏輯關(guān)系。

4 儀器測(cè)試
    系統(tǒng)硬件連接完成，軟件調(diào)試通過(guò)后。接著對(duì)儀器進(jìn)行了測(cè)試。
4．1 光源測(cè)試
    使LED驅(qū)動(dòng)電路的電流在O～300 mA范圍變化，測(cè)試LED的發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)出驅(qū)動(dòng)電流與光強(qiáng)的關(guān)系如圖9所示。

4．2 暗噪聲測(cè)試
    圖10使用本系統(tǒng)測(cè)試的本底值，測(cè)量時(shí)的溫度為24℃，積分時(shí)間為0．5 s，PMT加載負(fù)高壓1 000 V。由圖10可見(jiàn)，暗室的背景噪聲在50 c／s(counts persecond)之下，計(jì)算得出本底噪聲的平均光子計(jì)數(shù)為27．48 c／s，結(jié)果較為理想。

4．3 樣品測(cè)試
    完成系統(tǒng)的研制后，對(duì)金心吊蘭葉片的生物光子輻射延遲發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。首先將樣品放入暗室中黑暗處理5 min，而后用藍(lán)色LED光源光照1 min，測(cè)量其延遲發(fā)光衰減曲線，測(cè)量時(shí)間50 s，間隔1 s，重復(fù)測(cè)量三次，探測(cè)結(jié)果如圖11所示。分別對(duì)三組測(cè)量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)度進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，三組測(cè)量數(shù)據(jù)之阿的相關(guān)系數(shù)均接近O．999(見(jiàn)圖12(a)～(c))，結(jié)果表明該系統(tǒng)測(cè)量具有良好的可重復(fù)性，測(cè)量精度高。

5 結(jié)語(yǔ)
    本文設(shè)計(jì)了用于測(cè)量生物超弱發(fā)光的專(zhuān)用測(cè)量系統(tǒng)，系統(tǒng)的激發(fā)光源由單顆高亮度大功率LED及光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)成，用壓恒流源調(diào)整LED光照強(qiáng)度，通過(guò)電子快門(mén)精確控制光探測(cè)器的采集時(shí)間，暗室的背景噪聲在50 c／s之下。應(yīng)用本系統(tǒng)測(cè)量金心吊蘭葉片的延遲發(fā)光的結(jié)果表明，該系統(tǒng)測(cè)量精度高、重復(fù)性好，得到了較理想的測(cè)量結(jié)果。