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[導(dǎo)讀]為增進(jìn)大家對(duì)分光光度計(jì)的認(rèn)識(shí),本文將對(duì)分光光度計(jì)的應(yīng)用以及分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)予以介紹。

分光光度計(jì)具有重要應(yīng)用,不管是在工業(yè)環(huán)境還是實(shí)驗(yàn)室中,都有分光光度計(jì)的身影。為增進(jìn)大家對(duì)分光光度計(jì)的認(rèn)識(shí),本文將對(duì)分光光度計(jì)的應(yīng)用以及分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)予以介紹。如果你對(duì)分光光度計(jì)具有興趣,不妨繼續(xù)往下閱讀哦。

一、分光光度計(jì)用于核酸定量

核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測(cè)試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。

二、分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

1)為了防止光電管疲勞:不測(cè)定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開,使光路切斷,以延長(zhǎng)光電管使用壽命。

2)比色皿的使用方法:

①拿比色皿時(shí):手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。

②清洗比色皿時(shí):一般先用水沖洗,再用蒸餾水洗凈。如,比色皿被有機(jī)物沾污,可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1:2)浸泡片刻,再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗比色皿,以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿,以免損傷它的透光面。每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)立即洗凈比色皿。

③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干:以保護(hù)透光面。

④測(cè)定有色溶液吸光度時(shí):一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次,以免改變有色溶液的濃度。另外,在測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí),通常都按由稀到濃的順序測(cè)定,以減小測(cè)量誤差。

⑤在實(shí)際分析工作中:通常根據(jù)溶液濃度的不同,選用液槽厚度不同的比色皿,使溶液的吸光度控制在0.2~0.7。分光光度計(jì)的維護(hù)和保養(yǎng)分光光度計(jì)是精密儀器,正確安裝、使用和保養(yǎng)對(duì)保持儀器良好的性能和保證測(cè)試的準(zhǔn)確度有重要作用。

1.對(duì)儀器工作環(huán)境的要求分光光度計(jì)應(yīng)安裝在穩(wěn)定的工作臺(tái)上,(周圍不應(yīng)有強(qiáng)磁場(chǎng), 以防電磁干擾),室內(nèi)溫度應(yīng)保持在(10~30)℃。室內(nèi)應(yīng)干燥,相對(duì)濕度宜控制在<85 %,室內(nèi)應(yīng)無腐蝕性氣體,光線不宜過強(qiáng)。

2.儀器保養(yǎng)和維護(hù)方法

(1)儀器工作電壓一般為220V,允許±10 %的電壓波動(dòng)。為保持光源燈和檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,在電源電壓波動(dòng)較大的實(shí)驗(yàn)室最好配備穩(wěn)壓器。

(2)為了延長(zhǎng)光源使用壽命,在不用時(shí)不用開光源燈。如果光源燈亮度明顯減弱或不穩(wěn)定,應(yīng)及時(shí)更換新燈。更換后要調(diào)節(jié)好燈絲位置,不要用手直接接觸窗口或燈泡,避免油污沾附,若不小心接觸過,要用無水乙醇擦拭。

(3)單色器是儀器的核心部分,裝在密封盒內(nèi),不能拆開,為防止色散元件受潮發(fā)霉,必須經(jīng)常更換干燥劑。

(4)必須正確使用吸收池,保護(hù)吸收池光學(xué)面。

(5)光電轉(zhuǎn)換元件不能長(zhǎng)時(shí)間曝光,應(yīng)避免強(qiáng)光照射或受潮積塵。

以上便是此次小編帶來的分光光度計(jì)相關(guān)內(nèi)容,通過本文,希望大家對(duì)分光光度計(jì)具備一定的了解。如果你喜歡本文,不妨持續(xù)關(guān)注我們網(wǎng)站哦,小編將于后期帶來更多精彩內(nèi)容。最后,十分感謝大家的閱讀,have a nice day!

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